سلول بنیادی و miRNA :

بررسی ها نشان داده است که miRNA ها در تنظیم مولکولی بیان ژن های سلول بنیادی نیز دخالت دارند .

 در سال 2003 هوباری و همکارانش فهرستی از miRNA هایی که با روش کلونینگ ژنی و تعیین توالی از سلول های بنیادی موشی به دست آمده بودند گزارش کردند. سپس با استفاده از روش نورترن بلات بیان این miRNA ها بین سلول های بنیادی موشی و اجسام شبه جنینی (Embtyoid Body) بررسی و مشخص شد که بیان آنها در این دو مرحله سلولی متفاوت است . با مقایسه miRNA های تعیین توالی شده مشخص شد که بیان برخی از miRNA ها ویژه سلول های بنیادی است و در اجسام شبه جنینی هیچ گونه بیانی از آنها دیده نمی شود. همچنین مشخص شده که برخی از فاکتورهای رونویسی سلول های بنیادی از قبیل Nanog ، Sox2 و t4 Oc که در خود نوزایی نقش دارند با برخی از miRNA ها در ارتباط هستند . علاوه بر این ، مناطق پروموتری mir-137 و mir-301 نشانه هایی از تنظیم توسط Nanog ، Sox2 و Oct4 به همراه دارند که می تواند بیانگر تنظیم این ژن ها توسط این فاکتورهای رونویسی باشد.

 اجسام شبه جنینی نیز miRNA های خاص خود را دارند که احتمالاً مخصوص مراحل پیش از لانه گزینی جنین و مراحل اولیه تکوین است . در واقع هیچ کدام از سلول ها پس از مرحله لانه گزینی تشابهی در بیان miRNA ها با سلول های بنیادی تمایز نیافته ندارند.

یافته های دیگر بیانگر این واقعیت است که بیان خوشه ای miR-12-13-14 در کروموزوم 19 در فرایند تکوین بسیار حایز اهمیت است ، چرا که کاهش بیان آن بسیار زودتر از کاهش بیان Oct4 شروع می شود و بنابراین بسیار سریع تر از فاکتورهای رونویسی روی حالت بنیادینگی تأثیر می گذارد. در حال حاضر اطلاعات مربوط به miRNA های سلول های بنیادی جنینی انسانی به کندی در حال پیشرفت است و این مسئله به خاطر دشواری های تکنیکی در کشت این سلول هاست  

چرا که حفظ و توسعه سلول های بنیادی جنینی انسانی نیاز به وسایل و مهارت های خاص آزمایشگاهی دارد و به علاوه زمان دو برابر شدن (Doubling time) این سلول ها تقریباً 3 برابر سلول های موشی است.

که از این میان 16 مورد قبلاً از بافت های متفاوت انسانی گزارش شده بودند .

 بنابراین در مجموع 20 مورد به عنوان microRNA های ویژه سلول های بنیادی جنینی انسانی گزارش شده اند که 3 مورد از آنها کاملاً با انواع گزارش شده موشی در سال 2003 یکسان بوده و بقیه متفاوت هستند.

بررسی نشان می دهد که برخی از miRNA ها همچون miR-302d, miR-302c و miR-302b که از کروموزوم 4 انسانی رونویسی می شوند همولوژی نزدیکی با miR-302 دارند که از سلول های بنیادی جنینی موشی جدا شده است

 همچنین mir-371 ، miR372 و miR-373 که روی کروموزوم 19 قرار دارند همولوگ انسانی miR-290 ، miR-291s ، miR-291as ، miR-292s ، miR-292as ، miR-293 ، miR-294 و miR-295 در موش هستند. بنابراین می توان گفت که دو خوشه ژنی miRNA انسانی و موشی به صورت حفاظت شده ای در ژنوم وجود دارند با مقایسه miRNA های مطالعه شده ، به نظر می رسد می توان آن نوع RNA های تنظیمی را در سلول های بنیادی به چهار گروه زیر طبقه بندی کرد :

microRNA هایی مانند miR-302a ، miR-302b ، miR-302c ، miR- 302dو miR-367 که در هر دو نوع سلول بنیادی جنینی و سرطانی بیان می شوند و می توانند نقش حفاظت شده ای در سلول های پرتوان داشته باشند .

miRNA هایی مانند miR-154 ، miR-200 ، miR-371 ، miR-372 ، miR-373 و miR-368 که فقط در سلول های بنیادی جنینی بیان می شوند و می توانند عملکرد ویژه ای در این سلول ها داشته باشند .

. miRNA هایی مانند miR-21 ، miR-29 ، miR-301 ، miR-347 و Let-7a که در سلول های بنیادی جنینی نادرند اما در سلول هایی مانند HeLa دیده می شوند و احتمالاً در مراحل تکوین نقش دارند

miRNA هایی مانند miR-16 ، miR-17-5p ، miR-19b ، miR-26a ، miR-92 ، miR-103 ، miR-130a و miR-222 که در اکثر خطوط سلولی بیان آنها نشان داده شده و احتمالاً در عملکردهای عمومی سلولی نقش دارند . از مجموع این مطالعات می توان نتیجه گرفت که miRNA ها ممکن است تنظیم کننده اولیه حفظ حالت بنیادینگی و تمایز باشند و قبل از دیگر فاکتورهای بنیادینگی شناخته شده از جمله OCT4/NANOGعمل کنند .

miRNAها درتمایز:

 تاکنون مطالعات فراوانی در مورد miRNA هایی که در بافت های مختلف بیان اختصاصی دارند انجام و نقش آنها در تمایز بررسی شده است که به اختصار مواردی از آنها ذکر می شود .

آزمایش ها نشان داده است که بیان بیش از حد miR-124 که در مغز به طور طبیعی صورت می گیرد منجر به تغییر الگوی بیانی سلول های HeLa به سمت سلول های مغزی خواهد شد .

با توجه به مطالعات انجام شده ، miR-124a در حدود 25 تا 50 درصد کل miRNA ها را در بافت مغز تشکیل می دهد و همچنین مشخص شده است که این miRNA ها در انتقال پیش سازه های عصبی به نرون از طریق سرکوب فعالیت ژن های غیرعصبی مؤثرند.

 در یک تحقیق مشابه بیان بالای miR-1 این سلول ها را به سمت سلول های عضلانی پیش می برد . این در حالی است که به طور طبیعی نیز در سلول های عضلانی بیان بالایی از miR-1 قابل ردیابی است .

اخیراً مشخص شده است که miRNA ها همچنین در تمایز سلول های هماتوپوتیک پستانداران نقش ویژه ای دارند.

 به عنوان مثال miR-181 در تیموس و سلول های لنفوسیت B موشی بیان مشخص دارد و می توان با بیان بالا در سلول های هماتوپویتیک باعث تمایز آنها یا سلول های پیش ساز آن ها به سلول های B شود.

 همچنین مشخص شده است که بیان بالای miR-181a تمایز به مگاکاریوسیت را سرکوب می کند ، به طوری که درالقای تمایز به مگاکاریوسیت بیان miR-181a ساخته شده توسط سلول از طریق مسیر آبشاری:

 استیل کولین استراز

 پروتئین کیناز – C

 پروتئین کیناز – A

اهش می یابد . این نتایج مشخص می کند که miRNA نقش مهمی در عملکرد سلول های بنیادی ، تمایز سلولی و ایجاد ویژگی های جدید در سلول ایفا می کند.

مدل های مطرح در تنظیم اپی ژنتیکی سلول های بنیادی :

بررسی اپی ژنتیکی سلول های بنیادی و سلول های تمایز یافته پیش ساز ، نشان داده است که رابطه پایداری بین مکانیسم های اپی ژنتیکی و ماهیت قابل توارث بودن آنها وجود دارد . براساس آنچه تاکنون ذکر شد شاخص های اپی ژنتیکی با وجود قابل توارث بودن و پایداری ، ماهیت کاملاً دینامیک و قابل برگشتی دارند و به واسطه عوامل مختلف تغییر دهنده ساختار کروماتین تنظیم می شوند . مدل های زیادی در خصوص مکانیسم عملکرد تغییرات اپی ژنتیکی در سلول های بنیادی توسط محققان مطرح شده است که در اینجا به اختصار ارایه می شود ، با این وجود باید در نظر داشت که تاکنون جزئیات کاملی از آنها مورد تأیید قرار نگرفته است . مدل اول:

بررسی ها نشان می دهد که علاوه بر:

 ژن های خانگی

 گروه دیگری از ژن ها که مسئول پرتوانی و خود نوزایی سلول های بنیادی هستند تقریباً در این سلول ها بیان دایمی دارند .

 طی تمایز سلولی ، ژن های مسئول بنیادینگی (که شامل ژن های اختصاصی برای سلول های بنیادی اند) خاموش خواهند شد و بیان فاکتورهای رونویسی اختصاصی دیگر باعث ظهور دودمان جدیدی از ژن های اختصاصی در جهت ایجاد سلول جدید می شود . این فعالیت سلسله مراتب به عنوان مدل فعالیت سلسله مراتبی (Hierarchical Activation: HA) مطرح می شود که با تغییر شبکه های رونویسی در طول تمایز و نمو سلولی صورت می گیرد.

در مدل دوم:

 تصور بر این است که اگرچه ژن های اختصاصی بافتی در سلول های بنیادی جنین بیان نمی شوند،اما این ژنها بطور اپی ژنتیکی برای بیان در مراحل بعدی نشانه دار شده اند. مطابق این مدل شکل گیری کروماتین فعال در سلول های بنیادی جنینی به وفور رخ می دهد ، اما این نواحی نشانه گذاری شده لزوماً فعالیت ضروری را به عهده ندارند و صرفاً به عنوان عوامل پیش برنده محسوب می شوند. انتخاب این نواحی ژنومی به وسیله ارتباط فاکتورهایی با ویژگی اتصال به توالی های خاص صورت می گیرد . این برهم کنش باعث فراخوان عوامل تغییر دهنده دیگری می شود که نهایتاً منجر به بیان ژن های اختصاصی دودمان های مختلف می شود .

مدل سوم:

مدل نشانگرهای مستعد به رونویسی در مراحل اولیه (ETCM: Early Transcription-Competent Marks model) براساس شواهدی مطرح شده است که نشان می دهد اگرچه بسیاری از ژن های مربوط به دودمان های خاص در سلول های بنیادی جنینی غیرفعالند ، ولیکن کروماتین این ژن ها برای بیان در مراحل بعدی نشانه گذاری شده اند. مدل سوم تحت عنوان پراکندگی یا آشفتگی رونویسی(PT: Promiscuous Transcription) نام گذاری می شود.

 در این دیدگاه سلول های بنیادی جنینی یک مجموعه ای از ژن های مختص به خود را به وسیله فاکتورهای ویژه ای رونویسی می کنند . اما برخلاف تأکید مدل HA(مدل اول) ، بقیه ژنوم به طور کامل خاموش نیست و بیشتر نواحی آن در سطح پایینی بیان می شوند . در سلول های تمایز یافته به طور هم زمان و گسترده از بیان ژن های مرتبط با بنیادینگی کاسته می شود و دسته دیگری از ژن های اختصاصی مسئول تمایز و حفظ آن شروع به رونویسی می کنند.

کشت سلول های بنیادی در محیط آزمایشگاه و تشکیل جسم شبه جنینی ، تقلیدی از مراحل اولیه نمو جنینی است .

 اجسام شبه جنینی تحت شرایط محیط کشتی مناسب می توانند به چندین رده سلولی تمایز یابند . بررسی های بیشتر روی مراکز تنظیمی رونویسی در سلول های بنیادی جنینی ، سه فاکتور رونویسی :

NANOG

 Sox2

 Oct-4

را به عنوان عوامل اصلی تأثیرگذار بر روی پروموتر این ژن ها معرفی می کند . از آن جایی که بیش از نیمی از این ژن ها غیرفعال هستند بنابراین فاکتورهای رونویسی فوق در هر دو فرایند فعال و غیرفعال کردن ژن ها مؤثرند .

 تاکنون مدل های مختلفی از چگونگی تنظیم اپی ژنتیکی بیان مارکرهای سلولی ، به خصوص در سلول های بنیادی مطرح شده است اما هیچ کدام از آنها قادر به توجیه همه ابعاد این فرایند نیستند . بنابراین دستیابی به مکانیسم های پیچیده سلولی ، نیاز به تحقیقات بیشتر دانشمدان دارد و حقیقت در آینده پنهان است.

متیلاسیون DNA :

   در اوایل دهه 1970 میلادی تحول عظیمی در زمینه اپی ژنتیک رخ داد .این تحول در ادامه کشف رویدادهای زیر صورت پذیرفت: 

کشف آنزیم هایی که DNA پستانداران به صورت حفاظتی و یا de novo متیله می کنند . امروزه این آنزیم ها در خانواده DNA متیل ترانسفرازها (Methyltransferase: Dnmts) طبقه بندی شده اند . پیدایش روش هایی برای شناسایی نواحی متیله مولکول DNA مانند روش های (Methylation Specific PCR: MSP) و به ویژه روش (Bisulfite Sequencing Analysis: BSA) که به طور مستقیم می توانند نوکلئوتیدهای متیله را شناسایی کنند .

کشف آنزیم های محدودالاثر ویژه ای که به متیلاسیون مولکول DNA حساس بودند و به تبع آن روش هایی مثل (Combined Bisulfite Restiction Enzyme Analysis: COBRA) که بر مبنای استفاده از این آنزیم ها طراحی شده اند .

شناسایی رابطه متیلاسیون ژن های ناهنجار و روند پیری .

شناسایی رابطه متیلاسیون  DNA وChromatin Remodeling و تأثیر آن در بیان ژن ها .

      متیلاسیون DNA بر روی باز سیتوزین در دی نوکلئوتیدهای سیتوزین – گوانین (CpG) روی می دهد.این فرایند تقریباً در همه مهره داران ، اکثر بی مهرگان و تعدادی از گونه های گیاهی دیده می شود ، اگرچه در گیاهان متیلاسیون بر روی بازهای دیگری نیز رخ می دهد. در پستانداران الگوی متیلاسیون به طور پایداری توسط آنزیم DNA متیل ترانسفراز (DNMT1)l- حفظ می شود . این آنزیم در هنگام همانند سازی در صورت متیله بودن رشته DNA مادری ، می تواند رشته تازه ساخته شده را متیله کند . این ویژگی به منظور حفظ الگوی متیلاسیون در پدیده ای به نام ایمپرنت ژنی بسیار حائز اهمیت است . DNA غیرمتیله به صورت de novo و به وسیله آنزیم های DNMT3a . DNMT3b و یا دیگر آنزیم های ناشناخته متیله می شود . دمتیلاسیون هم زمان با فرایند همانندسازی DNA ودرغیاب آنزیم DNMT1 به صورت دمتیلاسیون گذرا (Passive demethylation) صورت می گیرد .

 اما دمتیلاسیون فعال (Active demythylation)توسط آنزیم های دمتیلاز  در بسیاری از مراحل اولیه جنین پستانداران و نیز در سلول های سرطانی گزارش شده است . امروزه مشخص شده که جنین موش هایی که به علت نقص درآنزیم های DNMT1 و DNMT3a و DNMT3b دچار تغییر در الگوی متیلاسیون شده اند ، پس از لانه گزینی سقط می شوند . اگرچه هنوز علت و مکانیسم مرگ این جنین ها کاملاً مشخص نیست.       

RNA های تنظیمی کوچک مولکول:

میکرو RNA ها که آنها را به اختصار miRNA می نامند خانواده ای از RNA های کوچک مولکول با اندازه تقریبی 21 تا 25 نوکلئوتید به شمار می روند . این مولکول ها بیان ژن های خاصی را در سطح پس از رونویسی به طور منفی کنترل می کنند یعنی با عملکرد ویژه ای که بر روی مولکول RNA پیک (miRNA) دارند از ترجمه آنها به پروتئین جلوگیری می کند . در حال حاضر مشخص شده است که این عمل را از طریق اتصال به ناحیه مکمل خود در انتهای 3 منطقه (Untranslated region: UTR) مولکول mRNA انجام می دهند. miRNA اولین بار توسط Lee و همکارانش در سال 1993 معرفی شد ، آنها ابتدا این مسئله را در C.elegans یافتند و متوجه شدند miRNA در تکوین این جانور اهمیت خاصی دارد این کشف منجر به یافته های جدیدی در سال های اخیر شد و با کشف صدها miRNA که در بسیاری از فرایندهای سلولی مؤثرند ، هم اکنون اهمیت این کشف بیش از پیش آشکار شده است .  

به طور کلی می توان چند نقش مهم را برای miRNA ذکر کرد که عبارتند از:

1- مهار کردن ویروس ها

2- عناصر قابل جابه جایی (Transposable elements)

 3- سازماندهی کروموزوم

4- خاموش کردن ژن های کد کننده پروتئین.

miRNA ها در:

 تمایز سلولی

 تکثیر سلولی

 آپوپتوزیس

 از طریق سرکوب بیان ژن در مرحله پس از رونویسی نقش خود را ایفا می کنند . تاکنون بیش از 500 مولکول متفاوت microRNA در جانوران و گیاهان شناسایی شده است . اما انتظار بر این است که در آینده برای هر گونه بین 500 تا 1000 مولکول microRNA شناسایی شود . میزان پیش بینی شده در حدود 2 تا 3 درصد ژن های کد کننده پروتئین ارزیابی می شود. این مولکول ها الگوی بیان مشخصی را طی مراحل مختلف تمایز به بافت ها و سلول های متفاوت از خود بروز می دهند . به طور کلی جهت استاندارد کردن نام گذاری ابتدا از سه حرف miR که نماد miRNA است استفاده می شود و سپس عدد مشخصی را ذکر می کنند که برای هر نوع miRNA منحصر به فرد است .

سنتز miRNAها در سلول :

miRNA ها توسط RNA پلی مراز II رونویسی می شوند و در ابتدا مولکولی بزرگ در حدود 70 نوکلئوتیدند که primicroRNA نام دارد. این مولکول دارای ساختمان دوم است و ساختار سنجاق سری (hairpin) دارد . اندکی پس از رونویسی ، یک پروتئین آنزیمی به نام Drosha که حاوی دومین آنزیم RNase III است PrimicroRNA را در محل های خاصی برش می زند و آن را تبدیل به مولکول PremicroRNA می کند . پس از این مرحله PremicroRNA با کمک پروتئینی به نام Exportin5 از هسته به سیتوپلاسم منتقل می شود. در سیتوپلاسم پروتئین آنزیمی دیگری که بازهم دارای دومین RNase III است و Dicer نام دارد، PremicroRNA را برش می زند و یک مولکول RNA دو رشته ای پدید می آورد . یکی از این دو رشته عملکردی بوده و در کمپلکس RISC شرکت می کند .